经过改装的TB-3轰炸机，每个机翼下面各悬挂一架伊-16战斗机，挂载250公斤炸弹。
1940年，由于12.7毫米 UB重机枪的应用，促成了伊-16的最终改型——伊-16-29型。作为伊-16战斗机家族的最后一名成员，29型生产到了1941年（所有的伊-16自1934到1941年总共生产了9450架）。29型主要改进为一挺12.7毫米UB重机枪被安装在了整流罩的下方，这使原来的T型进气口被移动到了整流罩右舷的旁边。大多数都在脊背上安装了无线电，一些在右舷翼尖下携带了侦察照相机。挂载武器包括多种类型炸弹和4-6枚RS-82火箭。
当1941年德国入侵时，苏联大约有7000架伊-16在服役。尽管已经有些显得过时，然而它仍然作为卫国战争初期的主力战斗机发挥了不小的作用。如果德国飞行员要与伊-16缠斗的话，会发现伊-16的突然提速能力使它很容易在混战中抢占有利位置，这时德国飞机只能通过急速爬升或俯冲摆脱掉伊-16。最令人惊奇的是，有些飞行员受过特殊训练用伊-16去撞击德国轰炸机然后跳伞，理论上伊-16的撞击力允许飞行员在撞击之后从容跳伞。
伊-16作为战斗机一直使用到1943年，之后所有的伊-16基本都退居二线。
