为了随时开展活体实验，731部队在细菌战基地内秘密修建了两栋可以关押400人的“特设监狱”，并同日本军警、特务机构相互勾结，多渠道获取人体实验受试者。在这些人体实验受害者中，许多是被俘的抗日志士，731部队将他们称之为“木头”、“猴子”、“行李”，完全没有把他们当作人来看。
关于人体实验受害者的人数，731部队第一部部长川岛清少将在伯力被审判时供述：“每年被押进监狱里用作实验材料的有400-600人。每年因受实验死去的至少有600人，从1940年到1945年至少有3000人被用作人体实验材料，至于1940年以前被杀害的人究竟有多少，那我也不知道”。关东军宪兵司令部第三课长吉房雄中佐回忆说，“据估计至少有5000名爱国者，通过我们宪兵转到石井部队，最后成了实验品”。731部队自1933年组建之初就开始大规模进行人体活体实验，但由于这些被实验者全部被731部队专设的焚尸炉毁尸灭迹，731部队败逃时又销毁和转移了几乎所有档案，至今尚未找到1933-1938年人体实验受害者的记录。731部队所谓的研究“成果”，沾满了中国人、苏联人和朝鲜人的鲜血，其犯下的戕害人类罪，与纳粹在集中营集体屠杀犹太人的罪行相比，有过之无不及。
2. 诺门罕战争：一次凶残的细菌战。
1939年5月，日本发动了进攻苏联红军的诺门罕战争，731部队也第一次将细菌武器用于作战。据731部队老兵田村良雄供称：“1939年6月中旬，关东军防疫给水部本部在山口技师的指挥下，班员约6名，制造了细菌榴散弹，制造了约2000个(沾染细菌的)弹片，由山口班人员，在诺门罕前线用野炮发射出去。1939年7月上旬至8月下旬之间，我参加了细菌大量生产队小林队，生产供细菌作战使用的伤寒病菌、霍乱病菌、发疹伤寒病菌。我采取了约1公斤细菌运到将军庙、海拉尔等地。我和另外3人，在田部井班内，将每1毫升内含有30毫克的伤寒病菌菌液灌了两煤油桶，第二天我和另外2人将其运到将军庙，交给了关东军防疫给水部本部碇常重挺进队的难波准尉。我运去的细菌，被碇常重挺进队撒在哈拉哈河中，进行了细菌谋略战。”据记载，日军在诺门罕战场上至少实施了4次细菌战，731部队的头领石井四郎，也因为在诺门罕战场上的“贡献”被关东军司令部表彰授勋。
