在国民党二届一中全会上，蒋介石当选为中央执行委员会常委，毛泽东则继续代理中央宣传部部长。
与两年前的国民党 “一大”相比，蒋介石已判若两人。诚如台湾学者汪荣祖、李敖所说：“此前，蒋尚是一介武夫，党政地位在毛泽东之下。然而‘二大’之后，蒋氏直线蹿升，已是一人之下，万人之上了。 ”
蒋介石并未因此而满足。 3月20日，他借口“中山舰”叛变，宣布广州紧急戒严，包围汪精卫住宅。汪精卫以患病休养为由，一走了之。5月15日至22日，国民党二届二中全会通过蒋介石提出的 《整理党务案》。在国民党内担任部长的共产党员纷纷辞职，毛泽东亦于此时去职。
此后一段时间，毛泽东虽然不再是国民党的部长，但保留了候补中央执行委员的身份，并被任命为农民运动讲习所所长。他在国民党内仍有一定的影响，用孙科的话说，当会议久议不决时，只要“找于树德、毛泽东、恽代英、侯绍裘一疏通，会场中便没有问题了”。
此时，蒋介石和毛泽东形成了强烈的反差：—个高踞国民党的权力之巅，统领千军万马;—个是草鞋布衣，行走于山野田间。
1927年4月12日，蒋介石在上海发动反革命政变。
4月15日，蒋介石在南京以国民党中央的名义，对鲍罗廷、陈独秀等197人发出通缉，毛泽东名列第十一。
7月15日，汪精卫步蒋介石的后尘，实行“分共”。
8月1日，毛泽东同宋庆龄、邓演达、董必武等22人联名发表《中央委员宣言》，予以揭露和谴责，这是他最后一次使用国民党候补中央执行委员的名义。
饶有意味的是，国民党还欠了毛泽东的半年工资，共计720块大洋。这笔拖欠的工资，笔者以为应是毛泽东1927年1月至6月的收入。蒋介石虽然发动了 “四一二”政变，但是，毛泽东的名字在国民党花名册上注销，应该是在汪精卫“七一五”分共之后。